細胞凋亡（Apoptosis）是維持多細胞生物發育、穩態及免疫平衡的重要程序性死亡過程，其異常調控與腫瘤、神經退行性疾病、自身免疫病等密切相關。因此，準確檢測細胞凋亡是生命科學研究和臨床轉化中的關鍵需求。在眾多檢測方法中，Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術因高靈敏度、多參數分析及可定量等特點，成為細胞凋亡研究中常用的技術之一。本文將從原理、實驗設計及應用領域等方面，系統闡述該技術的核心價值。 一、技術原理：基于磷脂酰絲氨酸（PS）的膜不對稱性變化
細胞凋亡早期的核心特征之一是細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）向外側翻轉，暴露于細胞外環境。Annexin V是一種高度特異性的Ca²?依賴性磷脂結合蛋白，對PS具有強親和力，因此可通過標記熒光素FITC（異硫氰酸熒光素）的Annexin V（Annexin V-FITC）與暴露的PS結合，直接反映細胞凋亡早期狀態。
而碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種不能透過完整細胞膜的DNA染料，僅能進入膜受損的晚期凋亡或壞死細胞，與核內DNA結合后發出紅色熒光。通過同時檢測Annexin V-FITC（綠色）和PI（紅色）的熒光信號，可將細胞群體分為四類：
•Annexin V?/PI?：活細胞（無PS暴露，膜完整）；
•Annexin V?/PI?：早期凋亡細胞（PS暴露但膜未破裂）；
•Annexin V?/PI?：晚期凋亡/壞死細胞（PS暴露且膜損傷）；
•Annexin V?/PI?：機械損傷或壞死細胞（膜嚴重破壞，無PS特異性暴露）。
二、實驗設計與操作要點
為確保檢測結果的準確性，需嚴格優化以下環節：
1.樣本處理：細胞需經輕柔消化（如胰酶-EDTA）避免機械損傷，收集后PBS洗滌去除血清（含蛋白質可能干擾Annexin V結合），調整細胞密度至1×10?/mL。
2.染色條件：按說明書比例加入Annexin V-FITC和PI（通常終濃度分別為5μL/10?細胞和10μL/10?細胞），避光孵育15-20分鐘（室溫或4℃），避免時間過長導致假陽性。
3.上機檢測：使用流式細胞儀（如BD FACSCalibur）設置FITC通道（Ex/Em=488/530 nm）和PI通道（Ex/Em=488/620 nm），每管至少檢測1×10?個細胞，同時設未染色、單染（僅Annexin V或僅PI）對照以調節補償。
三、核心應用領域
1.基礎研究中凋亡通路的解析
在藥物研發中，Annexin V-FITC/PI可快速評估化合物對腫瘤細胞的促凋亡作用。例如，研究順鉑對肺癌A549細胞的影響時，通過雙染發現24小時即可誘導約30%細胞進入早期凋亡（Annexin V?/PI?），48小時晚期凋亡比例升至50%，為確定藥物作用時間窗提供依據。此外，結合Caspase抑制劑（如Z-VAD-FMK）可驗證凋亡是否依賴Caspase級聯反應，明確藥物作用靶點。
2.疾病機制研究中的細胞命運追蹤
在神經退行性疾病中，如阿爾茨海默病（AD）模型小鼠的海馬神經元，通過Annexin V-FITC/PI檢測可發現Aβ寡聚體處理后，凋亡細胞比例較對照組升高2倍，提示神經元丟失與凋亡密切相關。在自身免疫病中，如系統性紅斑狼瘡（SLE）患者外周血T細胞，雙染顯示其早期凋亡率顯著低于健康人，可能與抗凋亡分子Bcl-2過表達相關，為發病機制提供直接證據。
3.臨床治療監測與療效評估
在腫瘤化療中，該技術的動態監測價值尤為突出。例如，對急性髓系白血病（AML）患者化療前后的骨髓單個核細胞進行檢測，若早期凋亡率從5%升至25%，提示化療有效；反之，若晚期凋亡/壞死比例過高（>40%），則可能因藥物毒性導致正常細胞大量死亡，需調整方案。此外，在CAR-T細胞治療中，通過檢測靶細胞（如CD19?B細胞）的凋亡率，可實時評估回輸細胞的殺傷效果。
四、局限性與優化方向
盡管Annexin V-FITC/PI應用廣泛，仍需注意其局限性：①無法區分早期凋亡與自噬（部分自噬細胞可能PS暴露）；②壞死細胞與晚期凋亡細胞表型重疊，需結合其他指標（如7-AAD、Caspase-3活性）進一步驗證。未來，通過與線粒體膜電位探針（JC-1）、活性氧（ROS）檢測等聯用，可構建更全面的細胞死亡分析體系，推動精準醫學發展。
Annexin V-FITC/PI流式細胞術憑借其操作簡便、結果直觀的優勢，已成為細胞凋亡研究的標準工具。從基礎機制探索到臨床轉化應用，該技術不僅深化了我們對細胞命運的理解決，更為疾病診斷與治療提供了關鍵技術支撐。隨著多色流式與單細胞測序等技術的發展，其在生命科學與醫學領域的應用前景將更加廣闊。
更新時間：2026-01-21
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